中國林蛙皮膚生物活性肽的分離純化及其部分生物活性的研究.pdf

中國林蛙()是我國東北地區長白山末麓集藥、食、補于一體的珍貴蛙種，也是遼寧地區優勢藥用價值動物資源之一。目前，國內針對中國林蛙的研究多見于雌性中國林蛙輸卵管——蛤士蟆油的成分和功能等方面的報道，而對中國林蛙皮膚活性物質的研究少有報導。蛙類皮膚中含有大量的具有特殊分子結構、功能復雜多樣的生物活性物質，具有重要的應用價值及較大的開發利用潛力。著眼于疾病治療因子的篩選和生物活性分子的發現，如果能從中國林蛙皮膚中分離提取到具有重要應用價值的生物活性物質，必能豐富“北藥”資源，為更有效的開發利用中國林蛙資源奠定堅實的基礎。本論文選擇長白山末麓的撫順、本溪縣等地山區的中國林蛙為試驗材料，提取其皮膚中的生物活性肽，并通過對提取體系、抽提溫度、抽提時間等因素進行正交試驗的篩選優化，確定了活性肽較好且適合工業生產的提取條件和技術路線。中國林蛙皮膚中小分子生物活性肽對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌都具有一定的抗菌活性。對大腸埃希氏菌、黃色葡萄球菌、短小芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌、枯草芽胞桿菌和乳鏈球菌的抑菌效果好于嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌，其值為和，明顯低于嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌的值和。而且抗菌效果優于傳統的食品防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀，其抑菌效果是山梨酸鉀的數十倍。將胃肉瘤細胞接種至小鼠皮下，選取中國林蛙皮膚生物活性肽不同濃度樣品液，連續注射種瘤小鼠天后，計算抑瘤率；采用透射電鏡觀察細胞形態學變化、梯度瓊脂糖凝膠電泳技術、比色法、流式細胞檢測等技術觀察中國林蛙皮膚生物活性肽對腫瘤細胞凋亡過程的誘導。體內試驗結果表明，中國林蛙皮膚生物活性肽組分Ⅲ對小鼠胃肉瘤細胞有明顯的抑制作用。體外試驗結果表明，中國林蛙皮膚生物活性肽組分Ⅲ可以誘導、&#;、、、和等腫瘤細胞凋亡，其中對和&#;細胞的抑制作用最為明顯，其值分別為和。而且，誘導腫瘤細胞凋亡的試驗結果表明，顯微鏡下觀察可見細胞膜破損、細胞變形或出現胞芽和縊痕，透明度和亮度均降低，細胞內出現有異物感的顆粒，細胞增殖作用減低，活細胞數減少；電鏡下觀察，細胞皺縮變小，胞漿致密，核固縮，染色質濃集、邊聚化，形成不同形狀大小的塊狀，胞質空泡化等。流式細胞分析顯示，中國林蛙皮膚生物活性肽作用后，細胞期含量遠遠高于期含量的二倍，可以推測中國林蛙皮膚生物活性肽對細胞周期的作用點在期到期的關鍵點上。